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詳細(xì)解讀美國(guó)伯樂(lè)熒光定量PCR的工作原理
點(diǎn)擊次數(shù):2706 更新時(shí)間:2021-12-09
 
  美國(guó)伯樂(lè)熒光定量PCR(Real-timePCR),是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè),最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
 
  美國(guó)伯樂(lè)熒光定量PCR工作原理:
 
  以探針?lè)晒舛縋CR為例:PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。開(kāi)始時(shí),探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上,報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,檢測(cè)不到熒光信號(hào);PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
 
  傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí),擴(kuò)增反應(yīng)后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離,并且只能作定性分析,不能準(zhǔn)確定量,易造成污染出現(xiàn)假陽(yáng)性,使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量,且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動(dòng)化程度高和無(wú)污染的特點(diǎn),使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。
 
  在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里,熒光信號(hào)變化不大,接近一條直線,這樣的直線即是基線,這條線是可以自動(dòng)生成也可以手動(dòng)設(shè)置的。之后反應(yīng)會(huì)進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,這個(gè)期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性,在該期間,可設(shè)定一條熒光閾值線,它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,但一般會(huì)將熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為CT值,這個(gè)值與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系,且該值具有重現(xiàn)性。