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實(shí)驗(yàn)室的PCR污染問題如何處理
點(diǎn)擊次數(shù)：2476 更新時(shí)間：2017-09-28

生物實(shí)驗(yàn)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)都是微觀的，基于細(xì)胞，分子，蛋白水平，而這些微觀樣本對(duì)外界環(huán)境的影響敏感，比如溫度、ph值、酶解、損傷等，在我們盡力呵護(hù)樣本的生存環(huán)境的同時(shí)，污染也是需要注意的頭等大事，要堅(jiān)決避免環(huán)境中的“雜質(zhì)”的亂入，包括樣本污染，試劑儀器交叉污染、產(chǎn)物氣溶膠污染等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，防不勝防，假陽性結(jié)果讓無數(shù)生物學(xué)子抓狂和崩潰。

在眾多的生物實(shí)驗(yàn)室，分子生物學(xué)檢測(cè)方法如PCR因其高靈敏度、快速、操作方便等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，不過正是由于它靈敏度*，極微量的污染源都有可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽性，所以對(duì)環(huán)境污染的控制也極為嚴(yán)格。面對(duì)眾多的污染源，比如樣本交叉污染、試劑儀器交叉污染、克隆質(zhì)粒污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染、還有極容易忽視的氣溶膠污染，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，在空氣與液體面摩擦?xí)r，比如在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)非常重要而被忽視的污染源。

雖然這些污染對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響已經(jīng)受到了廣泛重視，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)污染控制都采取了各種辦法，比如定期大掃除清理、劃分操作區(qū)域、試劑分裝、操作謹(jǐn)慎、重復(fù)實(shí)驗(yàn)、多角度驗(yàn)證結(jié)果。但是微量的核酸片段就能被擴(kuò)增，所以對(duì)污染物的控制不僅僅是做到這些就能夠杜絕和避免的，關(guān)鍵是需要從源頭控制。目前多數(shù)生物試驗(yàn)室，分子實(shí)驗(yàn)每天都在大規(guī)模進(jìn)行，污染源已經(jīng)無處不在，特異性的，非特異性的，同源的，非同源的，廣泛分布在樣本容器、實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面，試劑溶液中、儀器表面內(nèi)管附著等等，你以為普通的清理就能解決這些污染源嗎？必須是不行的，實(shí)驗(yàn)室大拿們都為了清除這些污染源研究出好多種方法，整理跟大家共享。

傳統(tǒng)方式

原理

優(yōu)勢(shì)

不足

酒精擦拭

將核酸沉淀，擦拭后保證污染表面污染得到一定程度緩解

簡(jiǎn)單、方便、成本低

不*（核酸片段本身沒有變化，仍然存在導(dǎo)致氣溶膠污染的可能性）、細(xì)小孔徑器材無法清除

修飾

標(biāo)記遺傳物質(zhì)，阻止聚合酶與核酸的結(jié)合，從而抑制DNA擴(kuò)增

效果相對(duì)好

反應(yīng)可逆、成本高、試劑可能具有不安全影響

酶解

酶可將長(zhǎng)鏈的核酸分子降解成小片段

速度快，效果相對(duì)較好

降解的核酸中仍有大片段存在，具有完整的遺傳信息，可通過PCR擴(kuò)增出完整的片段、成本高

高壓變性

高壓可將核酸降解成20～30bp的小片段

*，成本低

僅適用于耐高壓材料，更無法應(yīng)用實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)和大型的實(shí)驗(yàn)設(shè)備

紫外照射

PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體，延伸終止

方便，范圍廣，成本低

僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大，且并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂

縱然有這么多解決核酸污染源的辦法，但是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室卻由于使用不方便、操作復(fù)雜、成本高、危害大而沒有持續(xù)采用，實(shí)驗(yàn)室累積的污染也就越來越多，有些實(shí)驗(yàn)者甚在ddH2O中擴(kuò)增出了條帶，結(jié)果可重復(fù)性差、投稿文章被質(zhì)疑，不得不重新實(shí)驗(yàn)，當(dāng)然在實(shí)驗(yàn)之前，必須要*清除這些污染源，這么嚴(yán)重的污染如何的清除，是一個(gè)迫在眉睫的問題。目前國(guó)外學(xué)者經(jīng)過不斷研發(fā)拓展，有一款清除劑DNA-ExitusPlus已經(jīng)問世，并得到了Nature Methods的推薦，此款清除劑純綠色配方，能夠?qū)⑽廴驹吹暮怂崞?降解成核苷酸為單位的極小片段，此過程不可逆，避免了污染重復(fù)的可能性，使用方便，使用與所有臺(tái)面，儀器擦拭，小部件浸泡等，無污染，無腐蝕性，對(duì)人體無危害。簡(jiǎn)直是廣大核酸污染受害者的福音啊。